Zu Beginn steht ein menschenähnlicher Hüne in einer urtümlichen Landschaft an der Kante eines großen Wasserfalls. Nachdem er aus einer kleinen Schale eine dunkle Flüssigkeit getrunken hat, beginnt sich sein Körper zu zersetzen und fällt in die Fluten. Im Wasser setzt sich seine zerfallene DNS neu zusammen und bildet neue Zellen, die sich teilen.
Im Jahr 2089 findet das Archäologenpaar Elizabeth Shaw und Charlie Holloway in einer Höhle auf der schottischen Insel Skye steinzeitliche Wandmalereien, die riesenhafte Wesen und eine Sternenformation zeigen. Shaw deutet die Szene als eine Schöpfungsgeschichte von Außerirdischen sowie eine Einladung: Die von ihr „Konstrukteure“ (der Menschen) genannten Schöpfer wünschen sich, so ihre Vermutung, von ihren Geschöpfen besucht zu werden. Als ihre Heimat wird der Mond LV-223 im 36,6 Lichtjahre entfernten Sternsystem Zeta2 Reticuli identifiziert.
Mit einer vom Tycoon Peter Weyland finanzierten Mission ist ab dem Jahr 2091 das Raumschiff Prometheus mit einer 17-köpfigen Besatzung auf dem Weg zu LV-223 und hat zur Weihnachtszeit des Jahres 2093 nach zwei Jahren Flugzeit das Ziel fast erreicht. Nachdem der Androide David die Crew aus dem Kälteschlaf weckt, begrüßt sie Weyland mit einer holografischen Botschaft und dem Hinweis, dass er wohl bereits gestorben sei, wenn sie seine Videobotschaft sehen. Außerdem stellt sich Meredith Vickers vor, die im Auftrag der Weyland Corporation die Expedition leitet.
Die Prometheus landet in einem Tal, auf dessen Oberfläche geometrische Linien entdeckt worden sind, die nicht natürlichen Ursprungs sein können. Lebewesen sind jedoch entgegen der Hoffnung der Forscher vorerst nicht aufzufinden. Ein Forscherteam rund um Shaw und Holloway erkundet das Innere eines bergähnlichen Gebildes. Der Geologe Fifield beginnt, mit autonomen Vermessungsdrohnen das Innere des Berges zu erforschen. Die Messergebnisse werden in Echtzeit an die Prometheus gesendet. Der Androide David, der während des Fluges die indogermanische Ursprache erlernt hat, entdeckt Hinweise darauf, dass die Bewohner von LV-223 vor etwas Unbekanntem geflohen sind.
Die Forscher entdecken bei der Erkundung des Berges einen Leichnam ohne Kopf vor einem Tor. Während Shaw und ein weiterer Wissenschaftler mit Hilfe der Radiokarbonmethode versuchen, das Alter des Toten zu bestimmen, öffnet David gegen Shaws Befehl das Tor. Auf der anderen Seite entdecken sie den abgetrennten Kopf des Astronauten sowie die riesige Skulptur eines menschlichen Antlitzes, das von urnenartigen Behältern umringt ist. Sie übersehen jedoch kleine Würmer, die am Boden kriechen. Wegen eines aufziehenden Sturms fordert Janek, der Kapitän der Prometheus, den Erkundungstrupp zur Rückkehr auf. Das Forscherpaar birgt den abgetrennten Kopf und kann damit im letzten Moment das Raumschiff erreichen. Die Forscher Milburn und Fifield, die aus Angst bereits im Vorfeld das Tunnelsystem verlassen wollten, verirren sich und müssen sich wegen des Sturmes über Nacht dort aufhalten.
Im Labor der Prometheus entpuppt sich der vermeintliche Schädel als Helm. Der darin befindliche Kopf eines „Konstrukteurs“ ist überraschend gut erhalten, doch zerplatzt er bei dem Versuch, ihn neurologisch zu stimulieren. Eine Analyse ergibt, dass die DNS des Wesens mit der menschlichen weitgehend übereinstimmt.
David öffnet unbeobachtet eine an Bord geschmuggelte Urne und entdeckt darin Ampullen mit einer dunklen Flüssigkeit. Er verabreicht Holloway heimlich einen Tropfen aus einer der Ampullen. Derweil protokolliert Shaw die Ergebnisse des Tages. Sie ist der Meinung, dass es in der Basis der Konstrukteure zum Ausbruch einer Seuche gekommen sei, der diese zum Opfer gefallen seien. Milburn und Fifield irren währenddessen durch das Tunnelsystem und entdecken die Überreste weiterer toter Außerirdischer. Sie gelangen zurück in den Raum mit den Urnen, aus denen nun eine gräuliche Flüssigkeit austritt. Diese hat die kleinen Würmer in kürzester Zeit genetisch verändert und stark wachsen lassen. Eines der Wesen greift Milburn an, schlüpft durch den Raumanzug und dringt in seinen Mund ein. Fifield versucht vergebens, Milburn zu helfen, indem er den Wurm durchtrennt; die unweigerlich herausspritzende Körperflüssigkeit durchätzt sein Helmvisier und verletzt ihn schwer. Vom Helm nicht länger geschützt, stürzt er mit dem Gesicht voran in eine Lache der dunkelgrauen Flüssigkeit.
Am nächsten Morgen führt Janek einen Suchtrupp in das Tunnelsystem. David setzt sich unbemerkt vom Trupp ab und entdeckt einen Raum mit hunderten der zuvor gefundenen Urnen, sowie eine Art Kommandoraum. Dort findet er einen Überlebenden der Besatzung im Kälteschlaf vor. Der Suchtrupp hat in der Zwischenzeit Milburns Leiche gefunden. Fifield ist verschwunden. Bei Holloway treten durch die von David verabreichte Flüssigkeit erste Symptome einer Krankheit auf. Der Suchtrupp kehrt eilig zur Prometheus zurück. Dort verweigert die mit einem Flammenwerfer bewaffnete Vickers dem bereits von starken körperlichen Veränderungen gezeichneten Holloway den Zutritt. Holloway begreift, dass es keine Hoffnung mehr für ihn gibt und er eine Gefahr für die restliche Crew darstellt, und provoziert Vickers ihn zu töten.
Shaw erfährt nach einem Körperscan von David, dass sie angeblich im vierten Monat schwanger sei. Tatsächlich wächst in ihr bereits in weniger als einem Tag, nachdem sie mit dem infizierten Holloway geschlafen hat, ein Fötus heran. David verweigert ihr die verlangte Abtreibung. Unter Schmerzen nimmt sie daher mit Hilfe eines Operationsroboters in Vickers abkoppelbarem Wohnquartier eigenständig einen Kaiserschnitt vor, entfernt die unbekannte, krakenähnliche Lebensform aus ihrem Körper und betäubt sie. Währenddessen taucht der durch die Exposition mit der fremdartigen Flüssigkeit mutierte Fifield an der Ladeluke der Prometheus auf und tötet mehrere Besatzungsmitglieder. Erst Janek und sein Copilot können Fifield überwältigen und ihn verbrennen.
Shaw stößt auf David und Peter Weyland. Von der Mehrheit der Besatzung unbemerkt, hatte dieser die Reise mit angetreten; er ist es, der dem Androiden David die Befehle erteilt. Vickers entpuppt sich als seine Tochter. Weyland ist dem Tode nah und hofft auf Rettung durch die Konstrukteure. Er ordnet eine weitere Exkursion zu dem Bauwerk an, die er selbst anführt.
Anhand der Scan-Analyse der durch Fifield gestarteten Drohnen stellt die Besatzung fest, dass es in seinem Inneren ein Raumschiff birgt, dessen Form der eines Hufeisens ähnelt. Im Kommandoraum dieses Raumschiffs angekommen, glaubt Shaw, dass die Konstrukteure gerade im Begriff waren zu starten, um alles Leben auf der Erde wieder zu zerstören, aber ihr Start durch eine Katastrophe vereitelt wurde. Auf Weylands Befehl hin erweckt David den letzten Konstrukteur aus dem Kälteschlaf und spricht zu ihm. Dieser aber reißt dem Androiden den Kopf ab und tötet Weyland und weitere Besatzungsmitglieder; nur Shaw gelingt die Flucht aus dem Raumschiff. Der Konstrukteur leitet den Start seines Raumschiffs ein, um seinen Auftrag zu Ende zu bringen: Kurs auf die Erde zu nehmen und die Menschheit zu vernichten.
Shaw beschwört über Funk die restliche Besatzung an Bord der Prometheus, mit allen Mitteln zu verhindern, dass der Konstrukteur die Erde erreichen kann. Vickers befiehlt Janek daraufhin, die Prometheus in Sicherheit zu bringen. Janek weist jedoch seine zwei Co-Piloten an den Ionenantrieb bereit zu machen, um auf Kollisionskurs mit dem Raumschiff des Konstrukteurs zu gehen. Er lässt Vickers die Wahl mit in den sicheren Tod zu gehen oder mit einer Rettungskapsel die Prometheus zu verlassen. Das zurückgelassene Rettungsquartier würde ihr ihr Überleben für zwei Jahre sichern. Vickers kann sich im letzten Moment auf die Mondoberfläche retten. Das abgestürzte Raumschiff des Konstrukteurs kippt jedoch auf sie und Shaw. Vickers wird erdrückt, aber Shaw überlebt an einer Felserhebung. Sie erreicht Vickers Rettungsquartier gerade noch rechtzeitig, bevor ihr Sauerstoffvorrat aufgebraucht ist. Durch das Türfenster des Operationsraums sieht Shaw, dass ihr krakenähnlicher Fötus noch lebt und zu beträchtlicher Größe herangewachsen ist. Sie erhält von Davids noch funktionsfähigem Kopf die Warnung, dass der Konstrukteur ebenfalls den Absturz überlebt hat und sie verfolgt. Im nächsten Moment ist dieser schon in das Rettungsquartier eingedrungen und stürzt sich auf Shaw, die daraufhin den Türöffner zum OP betätigt. Das krakenähnliche Ungetüm überwältigt den Konstrukteur und führt seine Fortpflanzungsextremität in dessen Mund ein.
David berichtet Shaw, dass es noch weitere Raumschiffe der Konstrukteure unter den anderen Kuppeln gebe und er die Fähigkeit habe, sie zu steuern. Shaw birgt daraufhin Davids Körperteile, aber unter der Bedingung, nicht zurück zur Erde, sondern zum Heimatplaneten der Konstrukteure zu fliegen. Sie möchte wissen, warum diese die Menschen erst erschufen und sie dann vernichten wollten. Sie setzt einen letzten Funkspruch ab und warnt davor, den Mond LV-223 aufzusuchen. Wenig später verlässt ein hufeisenförmiges Raumschiff den Mond vor der Szenerie seines Ringplaneten. Es ist der Neujahrstag des Jahres 2094.
Auf dem Mond bricht der Körper des überwältigten Konstrukteurs auf und es entsteigt ihm ein Wesen, das den klassischen Aliens dieser Filmreihe ähnelt – als Alien-Prototyp aus der Verbindung der Erbanlagen des krakenähnlichen Wesens mit denen des Konstrukteurs.
