Im Zentrum der Serie stehen die beiden besten Freundinnen Jane Rizzoli und Maura Isles. Rizzoli ist Detective bei der Bostoner Mordkommission. In dieser männerdominierten Welt kommt sie mit ihrem burschikosen Auftreten gut zurecht. Ihr engster Kollege und ehemaliger Partner ist der erfahrene Detective Vince Korsak. Zusammen mit Rizzolis Partner, dem jungen Barry Frost, bilden die drei ein erfolgreiches Ermittlerteam, bis Frost bei einem Verkehrsunfall ums Leben kommt.
Eine wichtige Rolle spielt häufig die Rizzoli-Familie. Janes Mutter Angela und ihr Vater Frank Sr. trennen sich im Verlauf der ersten Staffel, und im Folgenden nehmen erst Jane und später Maura Angela bei sich auf. Jane hat zwei Brüder: Frankie ist wie Jane Polizist, jedoch im Streifendienst. Er hält sich oft in Janes Umgebung auf, weil er daran interessiert ist, wie sie Detective zu werden. Korsak und Frost unterstützen ihn dabei, so dass er im Verlauf der zweiten Staffel die Detective-Prüfung angehen kann, letztlich jedoch nicht befördert wird und in der dritten Staffel Streifenpolizist bleibt. Erst nach dem Serien-Tod von Frost (dem Tod des Darstellers geschuldet) wird er vollwertiges Mitglied im Team. Janes und Frankies jüngster Bruder Tommy ist das „schwarze Schaf“ der Familie, der bereits mehrmals wegen kleinerer Delikte verurteilt wurde und zum Zeitpunkt der ersten Staffel im Gefängnis ist. Er kommt in der zweiten Staffel frei und versucht, ehrlich zu werden. In der dritten Staffel erfährt er, dass die Exverlobte seines Vaters ein Kind von ihm erwartet, das er nach dessen Geburt großzieht.
Im Gegensatz zur aus den einfachen Verhältnissen einer Arbeiterfamilie stammenden Jane Rizzoli ist Maura Isles ein Kind der Oberschicht von Boston. Als leitende Gerichtsmedizinerin des Bundesstaats Massachusetts arbeitet sie in allen Fällen eng mit Rizzolis Team zusammen. Isles ist wohlhabend, kultiviert, gebildet, modeinteressiert und ausgesprochen intelligent. Die sich daraus ergebenden sozialen und intellektuellen Gegensätze zwischen den Freundinnen Rizzoli und Isles werden in der Serie humorvoll inszeniert. Isles hat einige Angewohnheiten, die ihr den Umgang mit anderen Menschen (und auch Rizzoli) geringfügig erschweren, wie zum Beispiel ihre Ablehnung selbst trivialer Lügen, ihre Verweigerung unüberlegter Festlegungen, ihre biologistische Sichtweise von Emotionen und zwischenmenschlichen Beziehungen und ihr Unverständnis gegenüber einigen sozialen Gepflogenheiten. Isles ist bekannt, dass sie adoptiert wurde, und obwohl sie ihre Adoptiveltern als ihre wahren Eltern liebt und diese ebenso empfinden, ist das Verhältnis von Isles zu ihrer Mutter emotional schwierig. Die beiden können diese Kluft jedoch – auch durch Intervention Rizzolis – überwinden.
Im Verlauf der Serie stellt sich im Zuge einer Mordermittlung heraus, dass Isles’ biologischer Vater Patrick „Paddy“ Doyle ist, der mächtigste Unterweltboss Bostons. Diese Erkenntnis und der wiederholte Kontakt mit Doyle stürzen Isles in moralische Konflikte, da sie seine Taten uneingeschränkt verurteilt und fürchtet, durch ihre biologische Verwandtschaft ihm ähnlich zu sein. Andererseits entwickelt sie für ihn töchterliche Gefühle und profitiert auch von seinen Gewalttaten, als er einen ihr Leben bedrohenden Verbrecher tötet, um sie zu schützen. Im Finale der zweiten Staffel tötet er erneut einen Mörder, der seine Tochter gefährdet, und wird im Anschluss von Rizzoli angeschossen. In diesem Zusammenhang erfährt Maura Isles die Identität ihrer biologischen Mutter: Dr. Hope Martin ist eine international angesehene Pathologin und Isles in vielen Dingen ähnlich. Die beiden Frauen verstehen sich zunächst gut. Martin wurde jedoch von Doyle im Glauben gelassen, dass Maura bei der Geburt gestorben sei, und reagiert auf die Enthüllung der Wahrheit abweisend. Später kehrt sie zurück, da ihre kranke Tochter eine Spenderniere benötigt, die Isles nach einigem Zögern bereit ist zu spenden.
Die Hintergrundgeschichte der Serie beruht auf dem Roman Die Chirurgin. Einige Zeit vor dem Beginn der Serie ermittelte Jane Rizzoli im Fall des Serienmörders Charles Hoyt. Hoyt, der aus einer medizinischen Fakultät ausgeschlossen wurde, nutzte seine umfangreichen medizinischen Kenntnisse, um Frauen systematisch zu foltern und zu töten. Letztlich brachte er Rizzoli in seine Gewalt und spießte ihre Hände mit Skalpellen auf den Boden. Als er Rizzolis Kehle aufschlitzen wollte, schoss ihr Partner Korsak Hoyt zu Boden und rettete Rizzoli das Leben. Diese Geschehnisse werden in der Fernsehserie nur in Rückblenden erzählt. Seit diesen Ereignissen ist Rizzoli traumatisiert, während Hoyt eine Fixierung, sie zu ermorden, entwickelt hat.
Die Pilotfolge „Wundmale“ (1×01 See One, Do One, Teach One) basiert größtenteils auf dem Roman Der Meister. Rizzoli und Isles ermitteln im Fall eines Mörders, der Hoyts Vorgehensweise kopiert hat und ebenfalls nekrophil ist. Rizzoli und Isles entdecken, dass der Nachahmer ein Soldat ist, der in der medizinischen Fakultät auf Hoyt traf und nun Hoyts Vorgehensweise nachahmt. Unterdessen entkommt Hoyt aus dem Gefängnis und trifft seinen „Lehrling“. Sie fangen Rizzoli und versuchen, sie zu töten. Sie schafft es, die beiden zu entwaffnen und verbrennt Hoyts Auge mit einer Fackel. Mithilfe einer Elektroschockpistole kann sie sich verteidigen und erschießt daraufhin den „Lehrling“. Als Hoyt zu einer Waffe greift, schießt sie ihm durch die Hände und bringt ihm so Verletzungen bei, die denen ähnlich sehen, die er ihr einst zugefügt hat. Hoyt wird wieder in Haft genommen, doch Rizzoli und Isles werden in der Episode „Eiskalt“ (1×08 I’m Your Boogie Man) erneut mit ihm konfrontiert, als ein weiterer „Lehrling“ Hoyts – die Frau eines Opfers, die Hoyt verfallen ist – Rizzoli und ihren Bruder Frankie entführt, um Hoyt aus dem Gefängnis freizupressen und sich an Rizzoli zu rächen. Sie kann jedoch von den beiden Geschwistern überwältigt und getötet werden. Schließlich arrangiert der an Krebs erkrankte Hoyt, der inzwischen in einem Gefängniswärter einen weiteren Helfer gefunden hat, in der Episode „Nemesis“ (2×10 Remember Me) einen Mord im Gefängnis und ködert Rizzoli mit Offenbarungen über ein von ihm vor einigen Jahren begangenen Verbrechen. Sein eigentliches Ziel ist es, Rizzoli und Isles zu töten, damit er nicht allein stirbt, doch dabei kann Rizzoli ihn überwältigen und töten.