The Agency wirft einen durchaus kritischen Blick – insbesondere aus Sicht der Protagonisten – hinter die Kulissen des Auslandsnachrichtendienstes CIA und seiner Machenschaften und Verstrickungen, ohne aber die Außenpolitik der Vereinigten Staaten, Machtmissbrauch, Wirtschaftspolitik, Terrorismus und deren Hintergründe und Ursachen zu erläutern oder grundsätzlich zu hinterfragen.
Im Zentrum jeder Folge steht eine spannend-beklemmend inszenierte verdeckte Operation der CIA in Ländern auf allen Kontinenten, unter anderem im Kampf gegen Attentate (auch seitens der CIA), Terrorismus, Drogenhandel, Geiselnahme, Wirtschaftskriminalität, Menschenhandel und insbesondere die „Interessenswahrung“ der USA.
Der Handlungsfaden (auch des Privatlebens der Charaktere) spannt sich in der ersten Staffel um den Undercover-Agenten Matt Callan (in der zweiten Staffel: A.B. Stiles) und begleitet ihn und ein kleines Team von Analysten, Außen- und Innendienstmitarbeitern in der CIA-Zentrale. Matt ist ein ehemaliger Special Forces, Ausbilder und überarbeiteter Mitarbeiter im operativen Außendienst, der bislang nie einen Befehl hinterfragt oder einen Einsatz abgelehnt hat. Sein Bruder Eric ist bei einem CIA-Einsatz in Bosnien und Herzegowina unter mysteriösen, der Geheimhaltung unterliegenden Umständen ums Leben gekommen, und Matt versucht, diese Hintergründe zu ergründen.
Zum Team gehören Lisa Fabrizzi, Erics Verlobte, Führungsoffizier und Leiterin der Terrorismusbekämpfung: Seit Erics Tod vergräbt sich Lisa in ihrer Arbeit, um über seinen Tod hinwegzukommen, scheint sich aber auch um Matt zu sorgen, der für sie mehr als nur Freundschaft empfindet. Terri Lowell ist eine gewissenhafte Computergrafikerin, neu im Team, mitten in ihrer Scheidung und hat Mühe mit ihrem Doppelleben – der Arbeit beim CIA und der Scheinidentität, welche die Mitarbeiter nach außen hin führen: Sie und ihr Arbeitskollege Lex sind unter anderem auf die Herstellung und Fälschung von Dokumenten und Ausweisen spezialisiert, welche die Agenten bei ihren Top Secret-Missionen benötigen.
Weitere zentrale Figuren sind Carl Reese, integrer Führungsoffizier und loyaler Assistent des Direktors der Agency und Joshua Nankin, der die Agenten als Chef der Technischen Abteilung mit dem für ihre Operationen notwendigen Dokumenten, Scheinidentitäten und Hintergrundinformationen versorgt. Jackson Haisley ist ein verwitweter Vater und leitender Analyst, der die eingehenden Informationen sichtet und zuhanden des Führungsstabs für die laufenden Operationen des CIA auswertet, gleichzeitig seine Arbeit zunehmend zu hinterfragen beginnt.
Und nicht zuletzt Alex Pierce (bis zur Hälfte der ersten Staffel der Direktor der CIA), ein überzeugter Patriot, der einerseits für die Operationen vor dem US-Senat die Verantwortung trägt und wenn nötig die Grenzen der glaubhaften Abstreitbarkeit ausdehnt. Andererseits versucht er, seine Position gegen seinen Amtsvorgänger (Robert Quinn) und mögliche Nachfolger (Senator Tom Gage) sowie gegen die konkurrenzierenden US-Geheimdienste und Behörden zu behaupten.