Die Serie nutzt den aus Akte X bekannten Mix aus thematisch selbstständigen „Monster-of-the-Week“-Folgen und der Verfolgung eines roten Fadens. Die Handlung bezieht sich teilweise auf bekannte moderne Legenden und Mythen verschiedenster Religionen.
Im Mittelpunkt der Serie stehen die Brüder Dean und Sam Winchester, deren Mutter von einem Dämon getötet wurde, als beide noch sehr jung waren. Ihr Vater John Winchester erzieht die beiden zu Jägern gegen alles Übernatürliche, um Rache an dem Mörder seiner Frau nehmen zu können. Die Brüder reisen quer durch die Vereinigten Staaten, jagen die verschiedensten Kreaturen und retten zahlreiche Menschenleben. Dabei bleibt es jedoch nicht und sie erkennen ihren wahren Platz in der Welt und dass im Universum nicht nur Dämonen, Geister und Werwölfe, sondern auch weitaus mächtigere Dinge existieren.