Im Kern der Handlung stehen die fiktive US-amerikanische Anti-Terror-Einheit Counter Terrorist Unit (CTU), für die Jack Bauer, die Hauptfigur, als Bundesagent tätig ist, und – in Staffel 7 – das FBI. Jede 24-Staffel deckt eine 24-stündige Handlungsspanne ab und schildert die Geschehnisse üblicherweise aus drei Sichten: Erstens werden – mit besonderem Gewicht auf Bauer – die Bemühungen der Ermittlungsbehörde gezeigt. Zweitens spielt die Situation des US-Präsidenten (Staffeln 2–8) bzw. eines Präsidentschaftskandidaten (Staffel 1), seines Stabs und seiner Regierung eine zentrale Rolle. Drittens nimmt die Serie oft die Perspektiven der Gangster bzw. Terroristen ein, mit deren Verbrechen der Staatsapparat konfrontiert wird. In den ersten beiden Staffeln liegt der Fokus zudem auf Bauers Familie, vor allem seiner Tochter Kim. In der Serie werden Terroranschläge gegen die Vereinigten Staaten, ihre Institutionen und Repräsentanten thematisiert, ein weiterer Schwerpunkt sind Attentate und die Einflussnahme auf hochrangige politische Funktionsträger.
