Teenager Miles Morales bemüht sich darum, die Erwartungen seines Vaters, des Polizisten Jefferson Davis, zu erfüllen. Miles wechselt in ein Internat, schleicht sich aber später am Abend raus und geht zu seinem Onkel Aaron Davis. Als er Miles zu einer verlassenen U-Bahn-Station bringt, um diese um ein Graffiti zu erweitern, wird Miles von einer radioaktiven Spinne gebissen und erlangt spinnenähnliche Fähigkeiten.
Miles kehrt zur Station zurück, um nach der Spinne zu suchen, und entdeckt einen Teilchenbeschleuniger, der von Kingpin gebaut wurde um auf parallele Universen zugreifen zu können. Wie man später erfährt, versucht Kingpin mithilfe dieser Maschine seine Familie zurückzuerlangen, die er nach seiner Meinung durch Spider-Man verloren hat. Miles wird hier Zeuge eines Kampfes zwischen Spider-Man, der versucht, den Collider zu deaktivieren, und Kingpins Vollstrecker Green Goblin und Prowler.
Spider-Man bemerkt Miles und versucht diesen aus dem Kampfgeschehen zu entfernen. Dabei stellt er fest, dass der Schüler, ebenso wie er, Spinnenkräfte besitzt und macht ihm das Versprechen zurückzukehren und seine Kräfte zu trainieren. Im weiteren Kampfgeschehen stößt Green Goblin Spider-Man in den Teilchenbeschleuniger und verursacht so eine Explosion, die diesen fast tötet. Verwundet gibt Spider-Man Miles einen USB-Stick, mithilfe dessen man den Teilchenbeschleuniger in einen unbrauchbaren Zustand versetzen kann. Außerdem teilt er dem Jungen mit, dass die Maschine die Stadt zerstören könnte, wenn sie reaktiviert wird. Miles beobachtet entsetzt, wie Kingpin Spider-Man tötet, bevor er vor Prowler flieht.
Miles probiert seine neu entdeckten Fähigkeiten in einem gekauften Spider-Man-Kostüm aus, beschädigt jedoch bei einem Sturz von einem Gebäude den USB-Stick. Am Grab von Spider-Man trifft Miles Peter B. Parker, eine ältere Version von Spider-Man aus einer anderen Dimension. Bei einem Treffen mit Peter entdeckt Miles versehentlich eine Fähigkeit, einen bioelektrischen Giftstoß auszustoßen, um sein Opfer außer Gefecht zu setzen. Peter erklärt sich widerstrebend damit einverstanden, Miles im Austausch dafür zu trainieren, dass er beim Stehlen von Daten hilft, um einen neuen USB-Stick zu erstellen. In Fisk's Forschungsanstalt entdeckt Miles, dass er auch die Macht hat, unsichtbar zu werden. Sie werden mit der Wissenschaftlerin Olivia Octavius konfrontiert, die Peter DNA-Proben entnimmt und enthüllt, dass er aufgrund von Zellverfall in Bälde sterben wird, sollte er noch länger in ihrer Dimension verweilen.
Miles und Peter werden beim Kampf mit Olivia Octavius und ihren Schergen von Gwen Stacy, Spider-Woman aus einer anderen Dimension, gerettet. Die Gruppe findet Peters Tante May Parker, die mehr Helden aus anderen Dimensionen schützt. Bei den Helden handelt es sich um Spider-Man Noir, Spider-Ham und Peni Parker. Bedingt durch ihre Herkunft aus fremden Paralleluniversen leiden sie ebenso wie Peter B. Parker an Anfällen. Miles bietet an, den Teilchenbeschleuniger zu deaktivieren, damit die anderen nach Hause zurückkehren können, aber die Helden vertreten die Ansicht, dass ihm für diese Aufgabe die nötige Erfahrung fehle. Miles zieht sich zu Aaron nach Hause zurück, wo er herausfindet, dass Aaron der Prowler ist. Er kehrt zu Mays Haus zurück. Kingpin, Prowler, Octavius, Scorpion und Tombstone sind ihm jedoch unbemerkt gefolgt, was zur Konfrontation führt. Miles flieht, wird aber von Aaron gefangen genommen und entlarvt sich. Aaron will Miles nicht töten und wird darum von Fisk erschossen. Miles flieht mit Aaron, aber dieser stirbt an seinen Verletzungen. Jefferson sieht Miles über Aaron trauern und kommt zu dem Schluss, dass Spider-Man ihn getötet hat.
Die Helden versammeln sich mit Miles in seinem Wohnheim. Peter fesselt Miles zu dessen eigenem Schutz an einen Stuhl, um zu verhindern, dass sich Miles auf den Weg zum Teilchenbeschleuniger macht. Er beschließt, sich zu opfern, indem er zurückbleibt und den "Collider" deaktiviert. Jefferson tritt kurz darauf vor Miles Tür und entschuldigt sich für seine Fehler. Miles gelingt es seine Kräfte zu beherrschen und begibt sich zu Tante May, wo er unterschiedliche Ausrüstungsgegenstände erhält und Peters Anzug neu einfärbt. Er schließt sich den Helden an und hilft ihnen, Kingpins Vollstrecker zu bezwingen, bevor es ihm mithilfe des USB-Sticks gelingt, sie nach Hause zu schicken. Kingpin und Miles kämpfen im gesamten "Collider" und ziehen Jeffersons Aufmerksamkeit auf sich. Als Miles fast getötet wird, erkennt Jefferson, dass Spider-Man nicht der Feind ist. Miles lähmt Kingpin mit seinem Giftstoß und zerstört dann den Teilchenbeschleuniger. Kingpin und seine Vollstrecker werden verhaftet und Jefferson erkennt Spider-Man als Helden an. Miles übernimmt die Verantwortung seines neuen Lebens. Zurück in ihren Heimatdimensionen kehren die Helden in ihr Leben zurück. Peter bereitet sich darauf vor, seine Beziehung zu Mary Jane zu erneuern, Spider-Noir löst schließlich einen Rubik's Cube, mit dem er in der alternativen Zeitleiste zu kämpfen hat, Peni repariert ihren Roboter, Spider-Ham genießt einen Hot Dog und Gwen findet einen Weg, um Miles über Dimensionen hinweg zu kontaktieren.